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Microscopio electrónico

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Microscopio electrónico de 1964.

Un microscopio electrónico usa electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar amplificaciones mayores antes que los mejores microscopios ópticos, debido a que la longitud de onda de los electrones es bastante menor que la de los fotones. El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1931 y 1936, quienes se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones.

Un microscopio electrónico de transmisión de barrido ha logrado una resolución superior a 50 pm en el modo imágenes anulares de campo oscuro[1] y ampliación de hasta aproximadamente 10 000 000× mientras que la mayoría de los microscopios ópticos están limitados por difracción a una resolución de aproximadamente 200 nm y ampliaciones útiles por debajo de 2000×. Los microscopios electrónicos utilizan campos magnéticos moldeados para formar sistemas de lentes ópticas electrónicas que son análogas a las lentes de vidrio de un microscopio de luz óptica.

Los microscopios electrónicos se utilizan para investigar la ultraestructura de una amplia gama de especímenes biológicos e inorgánicos, incluidos microorganismos, células, moléculas grandes, muestras de biopsia, metales y cristalinos. Industrialmente, los microscopios electrónicos se utilizan a menudo para el control de calidad y el análisis de fallas. Los microscopios electrónicos modernos producen micrografías de electrones utilizando cámaras digitales especializadas y capturadores de fotogramas para capturar las imágenes.

Historia

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Desarrollo inicial

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Réplicade uno de los primeros microscopios electrónicos de transmisión construidos por Ernst Ruska, xpuesta en el Museo Alemán de Múnich, Alemania
Microscopio electrónico de transmisión (1976)

Fueron muchos los avances que sentaron las bases de la óptica electrónica utilizada en los microscopios.[2] En 1873, Ernst Abbe propuso que la capacidad de resolver detalles en un objeto estaba limitada aproximadamente por la longitud de onda de la luz utilizada para la obtención de imágenes, o por unos pocos cientos de nanómetros en el caso de los microscopios de luz visible. Los avances en microscopía ultravioleta (UV), liderados por Köhler y Rohr, aumentaron el poder de resolución al doble.[3] Sin embargo, esto requería de una costosa óptica de cuarzo, debido a que el vidrio absorbía la radiación UV. Se creía que obtener una imagen con información submicrométrica era imposible debido a esta limitación de longitud de onda.[4]

En 1858, Plücker observó la desviación de los «rayos catódicos» (electrones) por campos magnéticos.[5] Un paso importante fue el trabajo de Hertz en 1883[6] que fabricó un tubo de rayos catódicos con desviación electrostática y magnética, demostrando la manipulación de la dirección de un haz de electrones. En 1891, Eduard Riecke observó que los rayos catódicos podían enfocarse mediante campos magnéticos, lo que permitía diseñar lentes electromagnéticas sencillas. Este efecto fue utilizado por Ferdinand Braun en 1897 para construir osciloscopios de rayos catódicos (cathode-ray oscilloscope, o CRO) sencillos.[7] En 1899 Emil Wiechert los focalizó mediante un campo magnético axial[8] y en 1905 Arthur Wehnelt usó cátodos recubiertos de óxido mejorados que producían más electrones.[9]

En 1926, Hans Busch publicó un trabajo que extendía esta teoría y demostró que la ecuación del fabricante de lentes podía, con las suposiciones adecuadas, llevar al desarrollo de la lente electromagnética y aplicarse a los electrones.[10][11] Según Dennis Gabor, el físico Leó Szilárd intentó convencerle en 1928 de que construyera un microscopio electrónico, para el que Szilárd había solicitado una patente.[12]

Hoy en día, la cuestión de quién inventó el microscopio electrónico de transmisión es controvertida.[13][14][15][16] En 1928, en la Technische Hochschule de Charlottenburg (actualmente Universidad Técnica de Berlín), Adolf Matthias, catedrático de Tecnología de Alta Tensión e Instalaciones Eléctricas, designó a Max Knoll para dirigir un equipo de investigadores con el fin de que avanzaran en la investigación sobre haces de electrones y mejoraran el diseño del osciloscopio de rayos catódicos. El equipo estaba formado por varios estudiantes de doctorado, entre ellos Ernst Ruska y Bodo von Borries. El equipo de investigación trabajó en el diseño de lentes y la colocación de las columnas del CRO, para optimizar los parámetros y construir mejores CRO, y en la fabricación de componentes ópticos electrónicos para generar imágenes de baja magnificación (casi 1:1). En 1931, el grupo logró generar imágenes ampliadas de rejillas de malla colocadas sobre la abertura del ánodo.[17][18] El dispositivo utilizaba dos lentes magnéticas para lograr mayores aumentos, lo que podría considerarse la creación del primer microscopio electrónico. (Ruska fue galardonado con el premio Nobel de Física de 1986 «Por su fundamental trabajo en óptica de electrones y por su diseño del primer microscopio electrónico»; Max Knoll murió en 1969, por lo que no recibió una parte del Premio Nobel.)

Aparentemente independiente de este esfuerzo fue el trabajo en Siemens-Schuckert por Reinhold Rüdenberg que patentó un microscopio electrónico con lente electrostática.. Según la ley de patentes (patente estadounidense n.º 2058914[19] y 2070318,[20] ambas presentadas en 1932), sería el inventor del microscopio electrónico, pero no está claro cuándo tuvo un instrumento operativo. Afirmó en un artículo muy breve en 1932[21] que Siemens había estado trabajando en esto durante algunos años antes de que se presentaran las patentes en 1932, sosteniendo que su esfuerzo era paralelo al desarrollo de la universidad. Murió en 1961, por lo que, al igual que Max Knoll, no pudo optar a una parte del Premio Nobe de 1986l.

Mejora de la resolución

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En aquel entonces, se entendía que los electrones eran partículas de materia cargadas; la naturaleza ondulatoria de los electrones no se comprendió completamente hasta la tesis doctoral de Louis de Broglie en 1924.[22] El grupo de investigación de Knoll desconocía esta publicación hasta 1932, cuando se percataron de que la longitud de onda de De Broglie de los electrones era varios órdenes de magnitud menor que la de la luz, lo que permitía teóricamente la obtención de imágenes a escala atómica. (Incluso para electrones con una energía cinética de tan solo 1 electronvoltio, la longitud de onda ya es de 1,18 nm). En abril de 1932, Ruska propuso la construcción de un nuevo microscopio electrónico para la obtención de imágenes directas de muestras insertadas en el microscopio, en lugar de simples rejillas de malla o imágenes de aperturas. Con este dispositivo se logró la obtención de imágenes de difracción y normales de una lámina de aluminio. Sin embargo, el aumento que se podía obtener era menor que con la microscopía óptica. En septiembre de 1933 se lograron aumentos superiores a los que se podían obtener con un microscopio óptico, con imágenes de fibras de algodón captadas rápidamente antes de que fueran dañadas por el haz de electrones.[4][23]

En ese momento, el interés por el microscopio electrónico había aumentado, y otros grupos, como el de Paul Anderson y Kenneth Fitzsimmons[24] de la Universidad Estatal de Washington[25] y el de Eli Franklin Burton y los estudiantes Cecil Hall, James Hillier y Albert Prebus. de la Universidad de Toronto, quienes construyeron los primeros TEM en Norteamérica en 1935 y 1938, respectivamente,[26] impulsaron continuamente el diseño de estos microscopios.

En 1936, Siemens continuó investigando en el microscopio electrónico y financió el trabajo de Ernst Ruska y Bodo von Borries, y empleó a Helmut Ruska, hermano de Ernst, para desarrollar aplicaciones para el microscopio y mejorar sus propiedades de imagen, especialmente con muestras biológicos.[23][27] En ese momento, se fabricaban microscopios electrónicos para grupos específicos, como el dispositivo "EM1" utilizado en el Laboratorio Nacional de Física del Reino Unido.[28] En 1939, el primer microscopio electrónico comercial, que se muestra en la imagen, se instaló en el departamento de Física de IG Farben-Werke[29] (según otras fuentes en 1938[30]).

El trabajo posterior con el microscopio electrónico se vio obstaculizado por la destrucción de un nuevo laboratorio construido en Siemens durante un bombardeo aéreo, así como por la muerte de dos de los investigadores, Heinz Müller y Friedrich Krause, durante la Segunda Guerra Mundial.[31]

También en 1937, Manfred von Ardenne fue pionero en el microscopio electrónico de barrido.[32]

Investigación posterior

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Tras la Segunda Guerra Mundial, Ruska retomó su trabajo en Siemens, donde continuó desarrollando el microscopio electrónico de transmisión, creando el primer microscopio con un aumento de 100.000x[31] (aunque los actuales son capaces de alcanzar dos millones de aumentos, como instrumentos científicos siguen siendo similares pero con una óptica mejorada.) La estructura fundamental de este diseño de microscopio, con óptica de preparación de haz multietapa, todavía se utiliza en los microscopios modernos. La comunidad mundial de microscopía electrónica avanzó con la fabricación de microscopios electrónicos en Manchester (Reino Unido), Estados Unidos (RCA), Alemania (Siemens) y Japón (JEOL). La primera conferencia internacional de microscopía electrónica tuvo lugar en Delft en 1949, con más de cien asistentes.[28] Posteriormente se celebraron conferencias, incluida la "Primera" conferencia internacional en Paris, 1950 y luego en Londres en 1954.

Con el desarrollo de la TEM, la técnica asociada de microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) fue reinvestigada y permaneció sin desarrollar hasta la década de 1970, cuando Albert Crewe, de la Universidad de Chicago, desarrolló el cañón de emisión de campo[33] y añadió una lente objetivo de alta calidad para crear la STEM moderna. Utilizando este diseño, Crewe demostró la capacidad de obtener imágenes de átomos mediante imágenes de campo oscuro anular. Crewe y sus colaboradores en la Universidad de Chicago desarrollaron la fuente de emisión de electrones de campo frío y construyeron una STEM capaz de visualizar átomos pesados individuales en sustratos delgados de carbono.[34]

Limitaciones del microscopio electrónico

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  • La limitada apertura no permite que la información detallada alcance la imagen, limitando de este modo la resolución.
  • El contraste de amplitud (que radica en la naturaleza corpuscular de los electrones) se debe al contraste de difracción, provocado por la pérdida de electrones del rayo. Es un contraste dominante en especímenes gruesos.
  • El contraste de fase (que radica en la naturaleza ondulatoria de los electrones) se debe al contraste de interferencia provocado por los desplazamientos en las fases relativas de las porciones del rayo. Es un contraste dominante en especímenes finos.
  • Existen también distintas aberraciones producidas por los lentes: astigmática, esférica y cromática.
  • El problema de la función de transferencia de contraste (CTF en inglés): la FTC describe la respuesta de un sistema óptico a una imagen descompuesta en ondas cuadráticas.

El material biológico presenta dos problemas fundamentales: el entorno de vacío y la transferencia de energía. Para resolverlos, se utilizan distintas técnicas dependiendo del tamaño de la muestra:[35]

  • para muestras grandes como órganos, tejidos o células, se utilizan tres técnicas:
  1. la fijación química o la criofijación;
  2. la inclusión en resinas (criosustitución);
  3. la réplica metálica.
  • para muestras pequeñas como complejos macromoleculares se utilizan las siguientes técnicas:
  1. la tinción negativa: los agentes de tinción más usados son el molibdato amónico, el fosfotungstato sódico y sales de uranio como acetato y formiato. Todos ellos presentan las siguientes propiedades: interactúan mínimamente con la muestra y son estables en la interacción con los electrones, son altamente solubles en agua, presentan una alta densidad que favorece el contraste, tienen un punto alto de fusión, tienen un tamaño de grano pequeño;
  2. la réplica metálica: para construir la réplica metálica se evapora el metal (estaño), que se deposita sobre la muestra a la vez que esta, por el vacío, se disuelve;
  3. la criomicroscopía. Desde la década de 1980, los científicos también han utilizado cada vez más el análisis de criofijación y muestras vitrificadas, lo que confirma aún más la validez de esta técnica.[36][37][38]

Tipos de microscopios electrónicos

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(1) carcasa, (2) emisor de electrones, (3) electrones, (4) cátodo, (5) ánodo, (6) Lente condensador, (7) muestra analizada, (8) Lente objetivo, (9) Lente proyector, (10) Detector (sensor o película fotográfica).

Existen dos tipos principales de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de transmisión y el microscopio electrónico de barrido.

Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

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El microscopio electrónico de transmisión (TEM en inglés) emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto cuya imagen se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan contra la muestra, formando así una imagen aumentada. Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de unos 2000 ángstroms. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar la imagen de un objeto hasta un millón de veces.

Microscopio electrónico de barrido (SEM)

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Imagen de una hormiga tomada con un MEB (microscopio electrónico de barrido).

En el microscopio electrónico de barrido (SEM en inglés) la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando la superficie. Apoyándose en los trabajos de Max Knoll de los años 1930 fue Manfred von Ardenne quien logró inventar el MEB en 1937 que consistía en un haz de electrones que barría la superficie de la muestra a analizar, que, en respuesta, reemitía algunas partículas. Estas partículas son analizadas por los diferentes sensores que hacen que sea posible la reconstrucción de una imagen tridimensional de la superficie.

Otros tipos de microscopios electrónicos

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Aplicaciones en distintas áreas

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En el estudio de los circuitos integrados se suele utilizar el microscopio electrónico debido a una curiosa propiedad: Como el campo eléctrico modifica la trayectoria de los electrones, en un circuito integrado en funcionamiento, visto bajo el microscopio electrónico, se puede apreciar el potencial al que está cada elemento del circuito.

La cristalografía de electrones es un método utilizado para determinar la disposición de átomos en sólidos a través de un microscopio electrónico de transmisión. Este método se utiliza en muchas situaciones donde no se puede usar cristalografía de rayos X y fue inventado por Aaron Klug.[40]

Referencias

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  2. ↑ Calbick, C. J. (1944). «Contexto histórico de la óptica de electrones». Journal of Applied Physics 15 (10): 685-690. Bibcode:685C 1944JAP....15.. 685C. ISSN 0021-8979.
  3. ↑ ultraviolet microscope. (2010). In Encyclopædia Britannica. Retrieved November 20, 2010, from Encyclopædia Britannica Online
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  7. ↑ «Ferdinand Braun, The Nobel Prize in Physics 1909, Biography». nobelprize.org.
  8. ↑ Wiechert, E. (1899). «Experimentelle Untersuchungen über die Geschwindigkeit und die magnetische Ablenkbarkeit der Kathodenstrahlen». Annalen der Physik und Chemie (en alemán) 305 (12): 739-766. Bibcode:1899AnP...305..739W.
  9. ↑ Wehnelt, A. (1905). «X. Sobre la descarga de iones negativos por óxidos metálicos incandescentes y fenómenos afines». The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science 10 (55): 80-90. ISSN 1941-5982.
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  12. ↑ Dannen, Gene (1998) Leo Szilard the Inventor: A Slideshow (1998, Budapest, conferencia). dannen.com
  13. ↑ Mulvey, T (1962). «Orígenes y desarrollo histórico del microscopio electrónico». British Journal of Applied Physics 13 (5): 197-207. ISSN 0508-3443.
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Enlaces externos

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